transmissão, reflexão e absorção
Transmissão, Reflexão e Absorção
Quando a luz atinge uma descontinuidade no meio pelo qual ela está se propagando, os comprimentos de onda que passam são ditos como sendo transmitidos e os comprimentos de onda que não passam são ditos bloqueados ou atenuados . Ao trabalhar com fluorescência, os filtros ópticos servem como a descontinuidade e podem ser feitos para transmitir seletivamente ou bloquear certos comprimentos de onda. Bloqueio (atenuação) pode ser realizado refletindo ou absorvendo luz pelo filtro e o grau em que um filtro transmite ou atenua a luz é completamente dependente de seus materiais constituintes e da maneira como eles são usados em sua construção.
Um arco-íris visto após a luz brilhante através de um prisma, por exemplo, é um espectro de luz transmitida. É uma visualização dos comprimentos de onda da luz que o material não conseguiu atenuar (refletir ou absorver).
Transmissão, reflexão e absorção são todas propriedades mensuráveis e são usadas para quantificar as formas pelas quais os materiais interagem com a luz. A ilustração acima destaca visualmente os princípios básicos de transmissão, reflexão e absorção.
2. Percentagem de Transmissão e Densidade Óptica
2. Percentagem de Transmissão e Densidade Óptica
A transmissão percentual (% T) é a unidade mais comum usada para expressar quantitativamente como um filtro óptico transmite luz. A transmissão percentual é medida em um determinado comprimento de onda (ou faixa de comprimento de onda) e é a razão entre a intensidade da luz transmitida (I) e a intensidade da luz incidente ( Io ), expressa em porcentagem:
- % T λ = I / I o * 100
O diagrama abaixo ilustra a terminologia tipicamente usada quando se discutem espectros expressos em% T. Essa figura é explicada mais adiante na seção Características do filtro .
Figura 5: Nomenclatura de Transmissão
O nível de atenuação (nível de bloqueio) e a faixa de atenuação (faixa de bloqueio) dos filtros são normalmente definidos em unidades de densidade óptica (DO). A densidade óptica usa as mesmas unidades que a absorbância da quantidade e é expressa como o log negativo da transmissão. Deve-se notar que não se deve tentar inferir a densidade óptica a partir de um gráfico de transmissão, um erro comum cometido por aqueles que trabalham com fluorescência. Expressa matematicamente:
- OD = -log T λ = -log [(% T λ ) / 100
- Exemplo: OD 4,5 = 3 x 10 -5 T (0,003% T)
Figura 6: Nomenclatura de Atenuação
3. Brilho do Sinal de Fluorescência
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MANUAL DE MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA (Use sua senha Mestra p/descompactar)
Vários fatores influenciam a quantidade de fluorescência emitida por uma amostra corada com uma determinada quantidade de intensidade de excitação. Esses incluem:
- A concentração do corante nas secções coradas da amostra e a espessura da amostra;
- O coeficiente de extinção do corante;
- A eficiência quântica do corante; e claro,
- A quantidade de material corado realmente presente no campo de visão do microscópio.
O coeficiente de extinção nos diz quanto da luz incidente será absorvida por um dado corante, e reflete as características de absorção dependentes do comprimento de onda indicadas pelo espectro de excitação do fluorocromo. A emissão é aumentada com maior absorção de luz incidente, o que significa que fluorocromos com maiores coeficientes de extinção tendem a emitir mais intensamente, e requerem menos energia para excitar adequadamente os mesmos. Embora muitos dos fluorocromos tenham altos coeficientes de extinção nos comprimentos de onda de pico de excitação, as técnicas práticas de preparação de amostras limitam frequentemente a concentração máxima permitida na amostra, reduzindo assim a quantidade total de luz realmente absorvida pela amostra corada. Experimentalmente,
A eficiência quântica, que é a razão entre a energia de luz absorvida e a fluorescência emitida, determina quanto dessa energia absorvida de luz será convertida em fluorescência. Os fluorocromos mais utilizados atualmente têm eficiências quânticas de aproximadamente 0,3-0,6, mas o valor real pode ser reduzido pela têmpera.
O produto desses fatores, além do fato de muitos espécimes terem quantidades muito pequenas de material corado no campo de visão observado, fornece uma razão de intensidade de fluorescência emitida para intensidade de luz de excitação em uma aplicação típica entre 1/10000 (10 -4 ) para amostras muito altamente fluorescentes e 1/1000000 (10 -6 ). Técnicas atuais (por exemplo, hibridização in situ por fluorescência), que utilizam quantidades mínimas de material fluorescente, podem ter razões tão baixas quanto 10 -9 ou 10 -10 . Assim, para ver a imagem fluorescente com contraste adequado, o microscópio de fluorescência deve ser capaz de atenuar a luz de excitação em até 10 -11.(para fluorescência muito fraca) sem diminuir o sinal de fluorescência. Esse conceito é discutido no Manual de Microscopia de Fluorescência. Como o microscópio de fluorescência corrige esse desequilíbrio? Os filtros ópticos são de fato componentes essenciais, mas a configuração inerente do microscópio de fluorescência também contribui muito para o processo de filtragem. Esta configuração única é o tópico de discussão na seção Microscopia de Fluorescência , mas primeiro discutiremos os filtros fluorescentes e suas características.
Terminologias da Microscopia Óptica - N.A.
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